ارزیابی روش Touchdown Nested PCR برای جلوگیری از اتصالات غیر اختصاصی و افزایش اختصاصیت در تکثیر ژنی ویروس های نقص ایمنی انسان و هپاتیت جی

مقدمه و هدف: یکی ازپارامترهای مهمی‌که درواکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز آشیانه‌ای برای بهینه‌سازی می‌توان در نظر گرفت، دمای دورگه شدن پرایمر با DNA الگو میباشد. یکی از تغییرات صورت گرفته در روش واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز معمولی استفاده از روش Touchdown PCR است که بر خلاف برنامه واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز معمولی و استاندارد که از یک دمای اتصال ثابت برای تکثیر توالی استفاده می‌شود، در این روش محدوده‌ای از درجه حرارت‌های اتصال استفاده می‌شود. مطالعه حاضر به منظور ازریابی کارایی روش Touchdown Nested PCR برای جلوگیری از اتصالات غیر اختصاصی و افزایش اختصاصیت در تکثیر ژنی طراحی و انجام شد. مواد و روش‌ها: این یک مطالعه تجربی است که طی سال‌های 1388 ـ 1387 در دانشگاه تربیت مدرس انجام شد. نمونه‌های جمعیت مورد بررسی در این مطالعه، 35 مورد پلاسمای بیماران آلوده به ویروس هپاتیت جی و 35 مورد پلاسمای بیماران آلوده به ویروس نقض ایمنی انسان بودند . بعد از استخراج اسید نوکلئیک، طراحی پرایمرهای مورد نظر برای دو ویروس نقص ایمنی انسان و هپاتیت جی و ساخت cDNA ، روش واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز آشیانه‌ای به دو صورت استاندارد و Touchdown بر روی نمونه‌های کنترل مثبت و منفی انجام شد. یافته‌ها: در تمامی ‌نمونه‌های مثبت باند مورد نظر مشاهده شد، در حالی که در هیچ یک از نمونه‌های کنترل منفی انسانی و ویروسی هیچ باندی مشاهده نشد. در نمونه‌های مثبت با روش استاندارد، پس از الکتروفورز محصولات واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز، باندهای غیر اختصاصی به ویژه در نمونه‌های ویروس نقص ایمنی انسان و به مقدار کمتری در نمونه های ویروس هپاتیت جی مشاهده شد. پس از اجرای پروسه Touchdown میزان باندهای ناخواسته و غیر اختصاصی، تا حد زیادی کاهش یافت و یا کاملاً حذف شد. نتیجه‌گیری: در مطالعه حاضر علی‌رغم شکل‌گیری باندهای ناخواسته در واکنش استاندارد، با اجرای پروسه Touchdown باندهای اضافی بدون این که اثر منفی در میزان محصول نهایی ایجاد شود، به میزان قابل توجهی کاهش یافتند. با توجه به سادگی این روش و نیز عدم ایجاد هزینه و مراحل کاری اضافی به نظر می‌رسد که استفاده از این پروتکل برای بهینه‌سازی سریع واکنش‌های زنجیره‌ای پلی‌مراز، روشی منطقی و به صرفه باشد.